Ultraviolet-A absorbance analysis in thin porcine corneas pre-and post-crosslinking

ABSTRACT Purpose: To determine the absorbance coefficient of the thin porcine cornea to ultraviolet-A radiation (365 nm) submitted for crosslinking. Methods: This in vitro, benchtop experiment using cadaver tissue study analyzed 12 porcine corneal lamellas, which were obtained using a microkeratome after mechanical de-epithelization and separated into three thickness groups: 180, 300, and 360 μm. The corneal thickness values were measured by anterior-segment optical coherence tomography. All lamellas had ultraviolet-A (365 nm) absorbance measured with a 96-well plate spectrophotometer using an ultraviolet transparent microplate before riboflavin instillation and preand post-crosslinking according to the Dresden protocol. Results: The ultraviolet absorbance profiles of the 180, 300, and 360 μm groups were obtained as α-coefficients of 12.85, 76.55, and 120.27, respectively. A theoretical formula was calculated though a statistical analysis that demonstrated the correlation between stromal lamellar thickness and ultraviolet absorbance. Conclusions: Corneal thickness and ultraviolet-A spectral absorbance of corneal lamellas showed linear correlation. These findings can potentially contribute to the optimization of ultraviolet-A application during crosslinking, making the treatment of corneas with thickness <400 μm safe and personalized energy delivery for each corneal thickness.

Enzima conversora de angiotensina no líquido pericárdico: estudo comparativo com a atividade sérica / Angiotensin-converting enzyme in pericardial fluid: comparative study with serum activity

FUNDAMENTO: A caracterização de uma enzima conversora de angiotensina (ECA) no líquido pericárdico humano é relevante diante do seu papel na liberação de angiotensina II e, portanto, do papel do pericárdio na homeostase cardivascular. OBJETIVO: Isolar e caracterizar uma ECA do líquido pericárdico humano. Comparar as atividades conversoras de angiotensina I do fluido pericárdico e do soro de pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular. MÉTODOS: A enzima do líquido pericárdico humano foi purificada por meio de etapas cromatográficas e caracterizada por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), hidrólise de angiotensina I, bradicinina, Hip-His-Leu e substratos sintéticos com supressão interna de fluorescência. Lisinopril foi usado como inibidor. A atividade de ECA foi determinada em amostras de sangue e líquido pericárdico de 23 pacientes submetidos à cirurgia cardiovascular. RESULTADOS: A ECA purificada (MM = 140 kDa) libera angiotensina II, hidrolisa a bradicinina e o substrato Hip-His-Leu. Os parâmetros cinéticos k cat,(s-1) e k cat/Km (µM-1. s-1) foram respectivamente: Hip-His-Leu (1,14 e 7 x 10 -4), Abz-YRK(Dnp)P-OH (2,60 e 0,77), Abz-LFK(Dnp)-OH (2,77 e 0,36) e Abz-SDK(Dnp)P-OH (1,92 e 0,19). As atividades conversoras de angiotensina I (média ± DP) do líquido pericárdico e no soro foram, respectivamente, 3,16 ± 0,90 mU x mg -1x min-1 e 0,33 ± 0,11 mU x mg -1x min-1 . A diferença foi significativa entre os dois fluidos. CONCLUSÃO: Uma ECA com grande similaridade com a enzima somática foi isolada do fluido pericárdico humano. A atividade conversora de angiotensina I é maior no líquido pericárdico quando comparada com a atividade do soro. Esses dados constituem importante evidência do papel do líquido pericárdico no metabolismo de peptídeos ativos.

BACKGROUND: The characterization of an angiotensin-converting enzyme (ACE) in human pericardial fluid is relevant, considering its role in the angiotensin II release and thus, the role of the pericardium in cardiovascular homeostasis. OBJECTIVE: To isolate and characterize an ACE from human pericardial fluid and to compare the angiotensin I converting activities of the pericardial fluid with that of the serum in patients submitted to cardiovascular surgery. METHODS: The enzyme from human pericardial fluid was purified through chromatographic steps and characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), hydrolysis of angiotensin I, bradykinin, Hip-His-Leu and synthetic substrates with internal fluorescence suppression. Lisinopril was used as inhibitor. The ACE activity was measured in blood and pericardial fluid samples of 23 patients submitted to cardiovascular surgery. RESULTS: The purified ACE (MM = 140 kDa), releases angiotensin II, hydrolyses bradykinin and the Hip-His-Leu substrate. The kinetic parameters k cat,(s-1) and k cat/Km (µM-1. s-1) were, respectively: Hip-His-Leu (1.14 and 7 x 10 -4) ; Abz-YRK(Dnp)P-OH (2.60 and 0.77), Abz-LFK(Dnp)-OH (2.77 and 0.36) and Abz-SDK(Dnp)P-OH (1.92 and 0.19). The angiotensin I converting activities (mean ± SD) in the pericardial fluid and in blood, were, respectively: 3.16 ± 0.90 mU x mg -1x min-1 and 0.33 ± 0.11 mU x mg -1x min-1. The difference was significant between the two fluids. CONCLUSION: An ACE that bears great similarity with the somatic enzyme was isolated from human pericardial fluid. The angiotensin I converting activity is higher in the pericardial fluid when compared to the serum activity. These data are important evidence of the role of the pericardial fluid in the metabolism of active peptides.

Estudo da especificidade dos sítios catalíticos da enzima conversora de angiotensina I e desenvolvimento de substratos seletivos para o domínio C / Specificirty study of the catalytic sites of angiotensin I converting enzyme and development of selective substrates for C-domain

No presente trabalho, usamos bibliotecas combinatórias de peptídeos com supressão intramolecular de fluorescência para fazer uni estudo detalhado da especificidade dos subsítios S3 a S1’ da enzima conversora de angiotensina 1 (ECA). Estes estudos permitiram o desenvolvimento de substratos seletivos para o domínio C da enzima. Para definir a especificidade do subsítio S1, ensaiamos uma primeira biblioteca com estrutura geral Abz-GXXZXK(Dnp)-0H, onde Z representa um dos 19 aminoácidos naturais (cisteína foi omitida para evitar dimerização) e X uma mistura destes aminoácidos incorporados aleatoriamente. Nossos resultados mostraram que os peptídeos contendo Arg e Leu em P1, apresentaram maior seletividade para o domínio C da enzima. As especificidades dos subsítios S1', S2 e S3 foram estudadas com as bibliotecas Abz-GXXRZK(Dnp)-OH, Abz-GXZRXK(Dnp)-OH e Abz-GZXRXK(Dnp)-OH, respectivamente. Nestas bibliotecas, um resíduo de Arg foi fixado na posição P1 para facilitar a solubilização dos peptídeos. Os nossos estudos com as bibliotecas permitiram demonstrar que o domínio C tem preferência por Phe em P1', Ile e Val em P3. Com base nestes resultados foram sintetizados os peptídeos Abz-GVILFK(Dnp)-OH e Abz-GVIRFK(Dnp)-OH, que contém os resíduos mais favoráveis em cada posição para o domínio C (P3-P1'). A redução gradativa da cadeia peptídica levou a um aumento de especificidade para este domínio. O substrato Abz-LFK(Dnp)-0H foi hidrolisado com eficiência catalítica 70 vezes maior pela ECA recombinante C-domínio (kcat/KM=36.7 M-1.s-1) do que pela ECA recombinante N-domínio (kcat/Km=0.51 M-1.s-1). Esta série de compostos foi testada também com a ECA purificada de testículo humano. Na segunda etapa do nosso trabalho estudamos uma isoforma de ECA, de aproximadamente 140 kDa, isolada de fluído de pericárdio humano. A enzima hidrolisou os substratos Abz-YRK(Dnp)P-0H (kcat=2,50s-1;Km=3,4 M; kcat/Km= 770 mM-1.s-1), Abz-LFK(Dnp)OH (kcat =2,77 s-1; Km= 7,7 M; kcat/Km= 358 mM-1.s-1) e Hip-His-Leu (kcat=1,14 s-1; Km,=1654 M; kcat/Km=0,69 mM-1.s-1)...